“考试难点“-微生物生化试验

“考试难点“-微生物生化试验

发布日期:2018-12-24 12:20:00

 

致病菌的检测中生化试验是必须了解的检测方法,下面小六收集了最全的生化检测试验的原理、方法和注意事项。

 

一.糖发酵试验

1.糖(醇)类发酵试验
不同细菌含有发酵不同糖(醇)的酶,因而发酵糖(醇)的能力各不相同。即使某些能发酵同样的糖(醇),但其产物也不同,有的产酸产气,有的产酸不产气,可根据这些特点来鉴别细菌。


大致可分为:
液体发酵管:无糖肉汤或蛋白胨水中,加入1%糖(醇)类指示剂,一支小玻管,经灭菌后备用。若被检细菌对营养要求较高时,则在试验前加入2%-5%无菌血清。


半固体发酵管:在液体糖(醇)发酵培养基中,加入0.3%-0.5%琼脂,溶化后分装试管,灭菌后让试管直立,使琼脂凝固,做成高层培养基,接种细菌应用接种针穿刺接种


固体发酵管:此类培养基一般不常用,仅用于营养要求较高的某些细菌,在含糖类及5%-10%血清琼脂斜面上进行发酵试验。另外固体高层糖发酵管,可用于厌氧细菌糖发酵试验,如产气荚膜杆菌在含糖的固体高层发酵管中出现汹涌发酵(产生大量气体)。


三糖斜面发酵管:含有葡萄糖乳糖蔗糖

 

各种糖(醇)发酵管含糖(醇)的浓度,一般为0.5%~1%,有时可达2%。经121℃20~30min灭菌,容易水解变质,特别是在碱性溶液中更易破坏。
故糖(醇)发酵培养基常用高压蒸汽115℃15min灭菌。
应用的糖(醇)种类很多
单糖:葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木胶糖、半乳糖;
双糖:乳糖、麦芽糖、蔗糖、覃糖;
多糖:菊糖、肝糖、糊精、淀粉
醇:  甘露醇、卫矛醇、山梨醇、侧金盏花醇、肌醇、丙三醇(甘油);
糖苷:水杨苷等。
最常用的指示剂酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、酸性复红。
前两者颜色反应较敏感,但稳定性差,后二者比较稳定。特别是一些迟缓发酵的细菌,培养时间长,应用后二者指示剂。
酚红pH6.8(黄色)-pH8.4(红色)


2.甲基红试验
甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)-pH6.2(黄色)产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸,但又很快将丙酮酸脱羧,转化成醇等物质,则培养液的pH值仍在6.2以上,故此时加入甲基红指示剂,培养液呈黄色,此为阴性对照菌。阳性对照菌是大肠埃希氏菌,呈现红色为阳性


3.V-P试验
目的是检查细菌是否能分解葡萄糖,产生乙酰甲基甲醇。
阳性对照菌是产气肠杆菌,分解葡萄糖(被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中,36℃ 18-24h)产生丙酮酸,再将丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇,在碱性条件下(乙液-40%KOH溶液),被氧化为二乙酰,与培养基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基结合,通常在10min内形成红色化合物。
若不显色,放置于50℃水浴2h,或放置于37℃培养箱中4h,充分摇动,观察培养液反应结果,不显红色为阴性,阴性对照菌是大肠埃希氏菌


4.ONPG试验
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷的缩写,利用该试剂可以检查被检细菌有无β-半乳糖苷酶和渗透酶,发酵乳糖的细菌具有这两种酶。
渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内,而β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断,产生葡萄糖和半乳糖。
迟缓发酵乳糖的细菌,缺乏渗透酶,而ONPG渗入菌细胞内,被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚,一般在20-30min内显黄色,为阳性,对照菌为枸橼酸盐杆菌和亚利桑那菌。
方法:将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上,37℃培养过夜。取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液。加入1滴甲苯,并充分振摇,使酶释放。在悬液中再加入ONPG液0.25ml,混匀,置于37℃培养箱或水浴箱中,分别在20min3h后观察培养液反应结果不出现黄色者为阴性,对照菌是沙门氏菌。


5.氧化发酵试验
测定糖类的氧化或发酵及糖类未被利用的代谢类型。
氧化型:细菌在分解葡萄糖过程中,必须有氧分子参加。无氧环境中不能分解葡萄糖。
发酵型:在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。
产碱型:不分解葡萄糖的细菌。
将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基,其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡油,高度不少于1cm,37℃培养48h或更长,观察反应结果。培养基变黄色为产酸。两支培养基均产酸为发酵型细菌,仅不加石蜡的培养基产酸的是氧化型细菌,两支培养基均不变化的为产碱型细菌。


.蛋白质、氨基酸及含氮化物代谢试验

 

1.苯丙氨酸脱氨酶试验
原理:某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶,可使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸,苯丙酮酸与三氯化铁发生螯合作用,形成绿色络合物。
方法:将被检细菌的斜面培养物(先增菌)大量移种到苯丙氨酸琼脂斜面上,37℃培养18-24h,再从斜面上滴加10%三氯化铁溶液4-5滴,使其自斜面培养物上缓缓流下,观察结果。溶液出现绿色为阳性,对照菌是变形杆菌;不变色为阴性,对照菌是产气肠杆菌。


2.脱羧酶试验
原理:某些细菌具有某种氨基酸的脱羧酶,可使氨基酸脱去羧基产生胺和二氧化碳,胺使pH值>7,此时指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为蓝色溴麝香草酚蓝酸性显黄色,碱性显紫色。
方法:将被检细菌接种到两支脱羧酶培养基中,其中一支不加氨基酸,另一支加赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸,再在培养基上覆盖一层灭菌的液体石蜡,37℃培养18-24h,观察结果。两管培养基均含有葡萄糖,产酸,溴麝香草酚蓝由蓝变黄。含有氨基酸的一管出现脱羧基降解作用,产生碱性反应,溴麝香草酚蓝再由黄变蓝,为阳性。
鸟氨酸阴性对照菌为阴沟肠杆菌,显黄色

 

3.靛基质(吲哚)试验
原理:某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合,形成玫瑰红色化合物。
方法:将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中,37℃培养24-48h后,滴加数滴试剂于培养基液面,轻轻摇动(不可剧烈振动),观察结果。出现红色为阳性,对照菌是大肠埃希氏菌;出现黄色为阴性,对照菌是产气肠杆菌。

 

4.硫化氢试验
原理:某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等),产生硫化氢,硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐反应,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
方法:将被检细菌以接种针穿刺接种于醋酸铅或双糖铁培养基(乳糖+葡萄糖)中,37℃培养24h,观察结果。有黑色出现为阳性
说明:在硫化氢试验的培养基加入硫代硫酸钠的作用是还原作用,以保持培养基处于还原状态,是产生的硫化氢不被氧化。产硫化氢较少的菌种可在试管口放置醋酸铅试条。


5.尿素酶试验
原理:某些细菌具有尿素酶,在含有尿素的培养基中,分解尿素产生氨,使培养基呈碱性,此时培养基中的酚红指示剂显红色。
方法:将被检细菌接种的尿素固体斜面培养基上,36℃培养4h检查一次,再每天检查一次,培养5天,观察结果。出现红色为阳性对照菌为变形杆菌;变色为阴性,对照菌是大肠埃希氏菌。


.枸橼酸盐利用试验

原理:枸橼酸盐培养基系一综合性培养基,其中枸橼酸钠为碳的唯一来源,磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源,能在培养基上生长,并且能分解枸橼酸盐,最后产生碳酸盐,使培养基变为碱性。培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不生长,培养基不变色。
方法:将被检细菌的菌悬液(挑取菌苔后,洗至生理盐水中)接种到枸橼酸盐培养基上,37℃培养24h,观察结果培养基上有菌生长,培养基变为深蓝色为阳性,对照菌是产气肠杆菌;若培养基不变色,则继续培养7天培养基仍不变色者为阴性,对照菌为大肠杆菌。


.呼吸酶类试验

1.氧化酶试验
原理:某些细菌具有氧化酶,能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化(先使细胞色素C氧化,电子传递体)成红色醌类化合物。
方法:取白色洁净滤纸蘸取待测菌落,加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴;Ewing氏改进法,再加α-萘酚溶液1滴观察结果阳性者立即出现粉红色,并逐渐加深,变为淡紫色,再到深紫色Ewing氏改进法阳性于0.5min内呈现鲜蓝色,对照菌为绿脓杆菌(铜绿假单细胞菌);阴性者颜色无变化Ewing氏法阴性为2min内不变色,对照菌为大肠杆菌。
1%盐酸二甲基对苯二胺溶液要避免接触含铁物质,防止出现假阳性反应。此试剂应少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,也可购置氧化酶试条。
该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科(阴性)与弧菌科(阳性)。


2.触酶活力试验
原理:具有触酶的细菌能催化过氧化酶,放出生态氧,继而形成氧分子,出现气泡。
方法:取3%过氧化氢0.5ml,滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上,或滴加到不含血液的肉汤培养物中,观察结果。培养物出现气泡者为阳性
说明:过氧化氢浓度过高(30%)会产生气泡出现假阳性;血液中含有触酶,容易出现假阳性


3.硝酸盐还原试验
原理:某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐,亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸,亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸,再与α-萘胺结合,生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(红色)。
方法:将被检细菌接种于硝酸盐培养基中,37℃培养1~4天,每天吸取培养物2ml,加甲液(对氨基苯磺酸0.8g,5mol/L醋酸100ml)和乙液(α-萘胺0.5g,5mol/L醋酸100ml)各数滴,同时以为接种细菌的培养基作对照,观察结果。出现红色为阳性
说明:亚硝酸盐在自然界分布很广,容易污染试剂,硝酸盐不纯或保管不妥也可能含有亚硝酸盐,因此必须做空白对照。繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌如果培养时间过久,可能将亚硝酸盐全部分解为氨和氮,出现假阴性反应,故需每天试验,空白对照。


.毒性酶类试验

1.溶血试验
原理:某些细菌在代谢过程中,产生溶血素,能使人或动物的红细胞发生溶解。
方法:
1)平板法:将被检细菌接种到血液琼脂平板培养基上,37℃培养24h。
2)试管法:取被检细菌16-18h肉汤培养物若干,加等量经生理盐水洗涤三次的2%羊红细胞悬液,置于37℃水浴箱中,30min后观察结果。
结果:
1)平板法:若菌落周围出现透明的溶血环,为完全溶血β溶血),菌落周围出现绿色溶血环,为不完全溶血(α溶血),无溶血环为不溶血(γ溶血)。
2)试管法:液体澄清透明为溶血,阳性

 

2.链激酶试验
原理:A群链球菌在代谢过程中,产生链激酶,能激活血液中的纤维蛋白酶原为溶纤维蛋白酶,促使纤维蛋白凝块溶解。
方法:取血浆0.2ml,放入灭菌小试管中,加无菌生理盐水0.8ml,再加被检细菌18-24h肉汤培养物0.5ml,充分混匀后,再加入0.25%氯化钙水溶液0.25ml,置于37℃水浴中,观察结果。
结果:10min内血浆先凝固,而后又开始溶解,溶解时间与链激酶含量成正比。链激酶含量多时,20min内凝固的血浆完全溶解。如无变化,应在水浴中持续2h、24h,分别观察结果。血浆凝块完全溶解者为阳性,时间越短表明毒性越强。24h血凝块仍不溶解者为阴性


3.血浆凝固酶试验
原理:某些细菌能产生血浆凝固酶,分两种,一种结合在细菌细胞壁上,遇到血浆直接作用于血浆的纤维蛋白,使细菌凝成颗粒状,使用玻片法;另一种分泌到细菌细胞外,称为游离血浆凝固酶,能使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白,使用试管法试验。
方法:
1)玻片法:取生理盐水2滴,分别滴于载玻片上,以接种环挑取被检细菌菌落,放在2滴生理盐水中,研磨成浓菌悬液。在1滴悬液中加1滴未稀释的血浆,另一滴加入1滴生理盐水作为对照,迅速摇动,观察结果。
2)试管法:取3支小试管,每支加1:4稀释的新鲜血浆0.5ml,其中1支加被检细菌生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml,另一支加阳性菌株生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml作阳性对照,再一支加生理盐水或肉汤培养液0.5ml作阴性对照。3支试管置于37℃水浴箱中,每隔30min观察一次结果。
结果:
1)玻片法:若在加血浆的1滴中迅速出现凝固颗粒,在加生理盐水对照的1滴中未出现凝固颗粒,为阳性;若超过2min才开始出现凝固颗粒者不作阳性(多为非致病性)。
2)试管法:6h内,若试验管和阳性对照管出现凝固,阴性对照管不出现凝固,为阳性;多数阳性细菌在0.5-1h内发生凝固。


.嗜盐试验
原理:在高于3%的氯化钠培养基上不生长或生长不好,但能在无言培养基上生长的,称为非嗜盐菌,如肠杆菌科。能在3%-6%氯化钠培养基上生长,但在无盐培养基上不生长,称为嗜盐菌,如副溶血性弧菌。在无盐和高盐培养基上均能生长,但长得不茂盛,称为耐盐菌,如葡萄球菌、铜绿假单细胞菌。
方法:取被检细菌分别接种到1支无盐葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化钠葡萄糖蛋白胨水中,37℃培养6-24h,观察生长情况。
结果:培养物出现浑浊生长为阳性

 

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